Physiological, genetic and molecular analysis of two Arabidopsis mutants with defects in normal development

• Physiologische, genetische und molekulare Analyse von zwei Arabidopsis-Mutanten mit Wachstumsdefekt

Pooraiiouby, Rana; Slusarenko, Alan (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2008)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Kurzfassung

Im Gegensatz zu tierischen Zellen, haben Pflanzenzellen eine feste Zellwand und können sich deswegen nicht bewegen. So sind sie nach der Zellteilung fest eingebettet in ihrer relativen Position zu den Nachbarnzellen. Daher ist die Orientierung der Zellteilungsebene kritisch für eine normale Pflanzenorganmorphogenese. Kortikale Mikrotubuli (MT) spielen eine wichtige Rolle in diesem Vorgang indem sie die Präprophasebande (PPB). Nach der Mitose bildet sich eine neue Zellwand während der Zellteilung in der Ebene zwischen den zwei Tochterzellen. Der Phragmoplast, eine weitere Struktur, die MT beinhaltet, bildet eine Ebene zwischen den zwei Tochterzellkernen aus und an ihm wird die neue Zellwand abgelagert. MT kommt bei der Festlegung des Pflanzenwuchshabitus eine weitere Rolle zu, da MT wichtig für die parallele Ausrichtung von Zellulosemikrofibrillen in der Zellwand sind. So bestimmen die MT-Muster das Muster der Zellulosemikrofibrillen auf der Außenseite der Plasmamembran. Die Ausrichtung der Zellulosemikrofibrillen hat wiederum Auswirkungen auf die Flexibilität der Zellwand und kontrolliert die Richtung des Zellexpansionswachstums. Pflanzenzellen werden durch pektische Polysaccharide, die Polygalakturonsäure enthalten, miteinander verbunden und Pektin ist ein Bestandteil der Matrix, die die Zellulosemikrofibrillen umgibt. Somit kommt MT und pektischen Polysacchariden eine aktive und wichtige Rolle bei der Ausprägung der Zell- und Organmorphologie zu. Während der Selektion von transgenen Arabidopsis Linien fielen zwei Mutanten auf, die interessante Phänotypen aufwiesen und wurden ausgewählt für weitere Untersuchungen. In der einen Mutante war ein Gen defekt, das für ein Enzym kodiert, das im Metabolismus von pektischen Polysacchariden beteiligt ist ("pgase"). Die andere Mutante ("bushy-ff") hatte T-DNA Insertionen in zwei Genen: eine in einem Gen, das bekanntermaßen Auswirkungen auf die MT Organisation hat und die andere in einem Gen mit unbekannter Funktion. In meiner Doktorarbeit charakterisierte ich diese beiden Mutanten. Im Spezifischen ging ich die folgenden Fragen an: Was sind die morphologischen und anatomischen Defekte in der "pgase" Mutante? Mit Licht- und Rasterelektronenmikroskopie konnte ich zeigen, dass die Pflanze im Durchmesser und der Höhe reduziert war und dass die Blätter etwas uneben waren. Bei den Geweben waren die auffallendsten Defekte, dass die Zahl der Trichome um ca. 30% verringert war und auch die Anzahl der Schließzellen der Spaltöffnungen im Vergleich zu dem Wildtyp verringert war. Was war die molekulare Ursache dieser Mutante? Thermal asymmetric interlaced (=TAIL) PCR zeigte eine T-DNA Insertion in einem Mitglied der Familie der Polygalakturonasen von Arabidopsis, At3g07970. Semi-quantitative RT-PCR zeigte eine ungefähr um Faktor 3 verringerte Expression von At3g07970 in der "pgase" Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Komplementation der Phänotypen der "pgase" Mutante durch Überexpresssion des "PGase" Gens und Untersuchungen an einer weiteren T-DNA Insertionsmutante im At3g07970 Gen, die morphologische Phänotypen aufwies, die sich nicht von denen der ursprünglichen "pgase" Mutante unterschieden, zeigten, dass diese Mutation verantwortlich für die beobachteten Phänotypen war. Zellwände sind wichtige Barrieren für biotische und abiotische Stressoren. Da die Mutation in einem "PGase" Gen wahrscheinlich zu Veränderungen in der Zellwand führt untersuchte ich die Antwort der "pgase" Mutante auf biotischen und abiotischen Stress. Dafür wurde die Mutante einer Infektion mit Hyaloperonospora arabidopsidis, Kälte, Hitze und Trockenstress ausgesetzt. Wir fanden dass diese Mutante erhöht anfällig gegenüber der Infektion mit H. arabidopsidis, Kälte und Hitze Stress war. Folgende Fragen wurden an der "bushy-ff" Mutante untersucht: Was sind die morphologishen und anatomischen Defekte in der "bushy-ff" Mutante? Mit dem Licht- und Rasterelektronenmikroskop fanden wir, dass alle Organe einschließlich der Wurzeln, Blätter und Blüten abnormal in dieser Mutante waren. Die "bushy-ff" Pflanzen waren in allen Dimensionen stark komprimiert. Auf der Gewebe- und Zellebene wurden verschiedene Defekte beobachtet, z. B. waren die Wurzelzellen der "bushy-ff" Pflanzen um ~30% kleiner als die von Col-0 Wurzelzellen, die Zahl der Trichome war ungefähr halbiert, die Verzweigung der Trichome war verändert und die Differenzierung des Mesophylls in Schwamm- und Palisadenmesenchym war fehlerhaft. Was war die molekulare Ursache dieser Mutante? Thermal asymmetric interlaced (=TAIL) PCR zeigte zwei unabhängige T-DNA Insertionen, eine im Promoter eines bis dato uncharakterisierten F-box Gens (At1g77000) und eine weitere im Promoter des bereits als kortikale MT organisierenden bekannten FASS Gens (At5g18580). Molekulare Analysen wiesen auf eine im Vergleich zum Wildtyp um 50% reduzierte Expression der FASS and F-box Gene hin. In Linien, in denen entweder F-box oder FASS konstitutiv im "bushy-ff" Mutanten Hintergrund exprimiert wurden, wurde beobachtet, dass in beiden Fällen die beobachteten "bushy-ff" Phänotypen komplementiert wurden. Dies legt nahe, dass die Mutationen in beiden Genen gleichzeitig vorhanden sein muss, um die "bushy-ff" Mutanten Phänotypen hervorzurufen. Genetische Experimente, die Kreuzungen von "bushy-ff" mit Wildtyp sowie Kreuzungen zwischen Einzelgen-Mutanten in f-box und fass Mutanten beinhalteten, bestätigten, dass beide Mutationen auftreten mussten und ausreichend waren für den "bushy-ff" Phänotyp. Das Gewebe-spezifische Expressionsmuster von F-box and FASS zeigte, dass beide Gene auf ungefähr gleichem Niveau in allen getesteten Geweben exprimiert wurden beruht die genetische Interaktion zwischen dem F-box und dem FASS Gen auf einer physikalischen Interaktion? Mittels dem Hefe-Zwei-Hybrid Systems konnten wir zeigen, dass F-box und FASS Proteine miteinander interagierten. Wo in der Pflanzenzelle findet sich das F-box Protein? Transgene Linien, die konstitutiv eine Fusion aus F-box und Grün-Fluoreszierendem Protein (GFP) im "bushy-ff" Mutanten Hintergrund exprimierten (35S::F-box-GFP), zeigten eine intrazelluläre Verteilung von F-box Protein, die sehr ähnlich zu der Verteilung eines MT-assoziierten Proteins war (GFP-TUA6). Zusammengefasst legen unsere Daten nahe, dass FASS kortikale MT organisieren könnte mittels der Interaktion mit dem F-box Protein.