Die Untersuchung von Allicin aus Knoblauch als Alternative zu konventionellen Antibiotika

  • Investigation of allicin from garlic as an alternative to conventional antibiotics

Reiter, Jana; Slusarenko, Alan (Thesis advisor); Rink, Lothar (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Allicin ist eine antimikrobiell wirksame Substanz, die bei der Verletzung des Knoblauchgewebes zum Schutz vor pathogenen Mikroorganismen und Schädlingen entsteht. Allicin zählt zur Gruppe der reaktiven Schwefel-Spezies (RSS) und oxidiert zelluläre Thiole, wie z.B. Cystein-Reste in Proteinen oder den Redox-Puffer Glutathion (GSH). Diese Oxidation kann die enzymatische Aktivität beeinflussen bzw. die Funktionalität inhibieren, und sogar bei höheren Konzentrationen zum Zelltod führen. In Rahmen dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob Allicin grundsätzlich das Potenzial zum Einsatz als Antibiotikum zur Behandlung bakterieller Lungeninfektionen in der Medizin hat. Die Oxidationsziele des Allicins wurden mithilfe der differenziellen Isotopen-kodierten Markierungsmethode OxICAT im bakteriellen Proteom identifiziert. Das Proteom des Allicin-anfälligen Pf0-1 und des Allicin-resistenten PfAR-1 wurden nach der Behandlung mit subletalen Allicin-Mengen miteinander verglichen. Bei der Kontrolle liegen die Proteine überwiegend im reduzierten Zustand vor: bei 77% der Proteine liegen Cysteine bis zu 20% oxidiert vor. Nach Allicin-Behandlung erhöht sich der Anteil der oxidierten Proteine: nur 54% der Proteine in dem Allicin-anfälligen Pf0-1, aber 66% der Proteine in dem Allicin-resistenten PfAR-1 bleiben zu weniger als 20% oxidiert. Als einer der spezifisch oxidierten Proteine wurde die Untereinheit A der DNA-Gyrase (GyrA) identifiziert. DNA-Gyrase ist ein bekannter Angriffsort für Antibiotika, da dieses Enzym nur in prokaryotischen Zellen vorkommt. Cys433 in GyrA liegt bei der Kontrolle nur zu 6% oxidiert vor. Nach Allicin-Behandlung steigt der Anteil des oxidierten Cys433 in dem Allicin-anfälligen Pf0-1 bis zu 56%, aber nur bis zu 11% in dem Allicin-resistenten PfAR-1. Allicin inhibierte die Aktivität der DNA-Gyrase aus E. coli in dem gleichen Konzentrationsbereich wie Nalidixinsäure, der erste entdeckte DNA-Gyrase-Inhibitor, bei in vitro Experimenten. Auf gereinigtes DNA-Gyrase-Enzym aus PfAR 1 und Pf0 1 wurde in in vitro Versuchen bei ähnlichen Allicin-Konzentrationen inhibiert. Der Austausch des gyrA-Gens in Pf0-1 durch das aus PfAR-1 führte zur höheren Anfälligkeit gegenüber Allicin in Vergleich zum Pf0-1 Wildtyp. Dies bedeutet, dass GyrA aus PfAR-1 keine erhöhte Allicin-Resistenz per se vermittelt und nicht für Allicin-Resistenz des PfAR-1 Stammes verantwortlich ist. Vielmehr ist es der genetische Hintergrund des PfAR-1 Stammes, der die DNA-Gyrase vor Oxidation durch Allicin schützt. Die Wirksamkeit des Allicins im Flüssigkultur gegenüber mehreren lungenpathogenen Bakterien-Stämmen (Acinetobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Streptococcus und Staphylococcus) unter anderem auch MDR-Stämmen (engl. multiple drug resistant), wurde gezeigt. Die minimalen hemmenden und bakteriziden Konzentrationen (MHK und MBK) wurden unter den standardisierten Bedingungen von EUCAST (engl. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) bestimmt und mit den Werten von konventionellen Antibiotika verglichen. Die zytotoxische Wirkung des Allicins wurde auf menschliche Lungen- und Darm-Epithelzellen und auf murine Fibroblasten-Zellen in vitro und in Gegenwart der protektiven Wirkung des GSH gezeigt. In Gewebeschnitten der Rattenlunge verringert sich die Sensitivität gegenüber Allicin bei GSH-Zugabe in Blutplasma-ähnlichen Konzentration von 1 mM. Dadurch, dass Allicin das bakterielle Wachstum von mehreren lungenpathogenen Bakterien (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae und Haemophilus influenzae) über die Gasphase inhibiert, bietet sich die direkte Inhalation des Allicins für die Behandlung der Lungeninfektionen an. Da bis jetzt noch keine gasförmigen Antibiotika zur Behandlung von Lungen-Infektionen verwendet werden, wäre Allicin, auch in den subletalen Konzentrationen, in Kombination mit oral-aufgenommenen konventionellen Antibiotika eine denkbare Ergänzung zu den aktuellen Behandlungsmöglichkeiten. Um die Allicin-Behandlung der infizierten Lungen zu simulieren wurde ein Lungen-Modell in Kooperation mit dem Aerodynamischen Institut der RWTH Aachen, das die menschlichen Bronchien der 2. bis 5. Generation darstellt, entwickelt. Die innere Fläche des Modells war mit 1 mm-dickem E. coli-haltigen Agar zur Simulation der bakteriellen Infektion beschichtet. Die Verwendung des Lungenmodells erlaubt das Beobachten der Ablagerung des antibiotisch wirksamen Aerosols an der „Bronchien“-Oberfläche des Modells ohne Notwendigkeit der Tierversuche. Die differenzielle Sensitivität der Test-Bakterien zu den verschiedenen Antibiotika sowie die konzentrationsabhängige Wachstumsinhibition wurden bei der Verwendung des Modells gezeigt. Bei der Behandlung der Bakterien über die Gasphase wurde der synergistische Effekt des Allicins mit Ethanol beobachtet. Die modellierte Luft-Strom-Geschwindigkeit innerhalb des Modells korreliert mit den Regionen, in denen das bakterielle Wachstum zuerst inhibiert wird. Dies lässt darauf schließen, dass das Lungen-Modell vorhersehbare Ergebnisse liefert und deren Verwendung bei initialen Untersuchungen und präklinischen Studien die Anzahl der notwendigen Tierversuche reduzieren kann.

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